Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Resumo

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Resumo

Nos mamíferos, muitos aspectos do comportamento e fisiologia, tais como ciclos de sono-vigília e metabolismo do fígado são regulados pela endógenos relógios circadianos (revisado ^1,2). O sistema de cronometragem circadiano é uma rede multi-oscilador hierárquica, com o relógio central, localizado no núcleo supraquiasmático (SCN) a sincronização e coordenação de relógios SCN-extra e periférico em outro lugar ^1,2. As células individuais são as unidades funcionais para a geração e manutenção de ritmos circadianos ^3,4, e estes osciladores de diferentes tipos de tecidos de um organismo a percentagem notavelmente semelhante mecanismo de feedback negativo bioquímico. No entanto, devido a interacções a nível de rede neuronal no SCN e através rítmicos, pistas sistémicos ao nível dos organismos, os ritmos circadianos no nível organismal não são necessariamente células autónoma ^5-7. Em comparação com estudos tradicionais de actividade locomotora in vivo e ex vivo explantes SCN, cell com base em ensaios in vitro permitir a descoberta de células autônomas defeitos circadianos ^5,8. Estrategicamente, baseados em células modelos são mais tratáveis ​​experimentalmente para a caracterização fenotípica e rápida descoberta de mecanismos de clock básico ^5,8-13.

Porque os ritmos circadianos são dinâmicos, medições longitudinais com alta resolução temporal são necessários para avaliar a função do relógio. Em anos recentes, a gravação em tempo real usando a bioluminescência de luciferase do pirilampo, como repórter tornou-se uma técnica comum para o estudo de ritmos circadianos em mamíferos ^14,15, uma vez que permite o exame da persistência e da dinâmica de ritmos moleculares. Para monitorar a célula-autónomos ritmos circadianos de expressão do gene, os repórteres de luciferase pode ser introduzido em células através de transfecção transiente ^13,16,17 ou transdução estável ^5,10,18,19. Aqui descrevemos um protocolo de transdução estável usando lentivírus mediada entrega de genes. Tele sistema vector lentiviral é superior aos métodos tradicionais, tais como a transfecção transiente e transmissão germinal devido à sua eficácia e versatilidade: ela permite a entrega eficiente e a integração estável no genoma do hospedeiro de ambos dividindo e não as células em divisão ^20. Uma vez que uma linha celular repórter é estabelecida, a dinâmica da função de relógio pode ser examinado através da gravação de bioluminescência. Nós primeiro descrever a geração de P (Per2)-D linhas repórter Luc, e em seguida, apresentam dados deste e de outros repórteres circadianos. Nestes ensaios, os fibroblastos 3T3 de rato e células de osteosarcoma humano U2OS são utilizados como modelos celulares. Também discutimos várias formas de utilizar esses modelos de relógio em estudos circadianos. Métodos descritos aqui podem ser aplicados a uma grande variedade de tipos de células para o estudo da base molecular e celular do relógio circadiano, e pode ser útil na resolução de problemas em outros sistemas biológicos.

Protocolo

1. Construção de Lentiviral Repórteres luciferase

A construção repórter de mamífero circadiano geralmente contém uma cassete de expressão no qual um promotor circadiano é fundido com o gene da luciferase. Ambas as estratégias de ligação e de recombinação baseada são comumente usados ​​para a clonagem de DNA. Como um exemplo, aqui descrevemos um método baseado em recombinação clonagem Gateway para gerar um P (Per2)-d repórter Luc lentiviral, em que a luciferase desestabilizado (d Luc) está sob o controle do promotor do rato Per2.

1. A clonagem do promotor Per2. Use PCR ....

Discussão

1. Modificações protocolo atual

1.1 dispositivos de gravação e considerações de rendimento

Devido à sua disponibilidade comercial, a LumiCycle (Actimetrics) tornou-se o dispositivo de luminimetro mais comumente utilizado automatizado para gravação em tempo real ^{4,5,9,19,29-31.} O LumiCycle emprega tubos fotomultiplicadores (PMT), como detectores de luz, que proporcionam sensibilidade extremamente elevada e baixo ruído ^14, e, por conseguinte, é par.......

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM	HyClone	SH30243FS	Para o crescimento celular normal
DMEM	Invitrogen	12100-046	Para luminometria
FBS	HyClone	SH3091003
Pen / Strep / Gln (100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-luciferina	Biosynth	L-8220
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
Todos os outros produtos químicos	Sigma
			Equipamento
De cultura de tecidos incubadora			5% de CO2 a 37 ° C
Capuz de cultura de tecidos			BSL-2 certificado
Light & fluorescente microscópio			O contraste de fase opcional
LumiCycle	Actimetrics